2結(jié)果與討論

2.1膠原蛋白肽的制備

完整的膠原是具有三螺旋結(jié)構(gòu)的原膠原分子，形成獨(dú)特的纖維結(jié)構(gòu)，交織成堅(jiān)固的網(wǎng)絡(luò)，提供結(jié)締組織的承受力。這樣的膠原是難以溶解的，也無法覆層至羥基磷灰石材料表面，因此必須對其進(jìn)行降解，為覆層提供材料。

為實(shí)現(xiàn)膠原蛋白肽分子量可控均一，分別比較了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解效果，在酶本身最適pH條件下，酶解至分子量不發(fā)生明顯變化，檢測其酶解后分子量分布(分子量計(jì)算依據(jù)圖1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，結(jié)果見表1。從表中結(jié)果可以看出不同的酶對膠原蛋白的酶解效果不盡相同，然而均未能達(dá)到控制其分子量在200~5 000 Da的預(yù)期效果。胰蛋白酶酶解速度最快，1 h酶解結(jié)束，而堿性蛋白酶是這幾種蛋白酶中酶解后分子量最小的。因此，將這2種最適pH為8.0的蛋白酶混合，經(jīng)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶。堿性蛋白酶為2:5時(shí)，2種酶同時(shí)作用可以在1 h內(nèi)將膠原蛋白酶解至200~5 000 Da(凝膠過濾色譜檢測結(jié)果見圖2)。堿性蛋白酶酶切位點(diǎn)為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Try，胰蛋白酶酶切位點(diǎn)為Arg、Lys，這2種酶的酶切位點(diǎn)無重疊，從而在酶解過程中協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了快速高效酶解。

圖1多肽分子量計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2膠原蛋白肽凝膠過濾色譜分析

表1酶解效果表

2.2膠原蛋白肽LB膜的制備

用LB膜分析儀研究了膠原蛋白肽LB膜的表面壓-面積曲線，如圖3所示。當(dāng)膠原蛋白肽氯仿溶液被滴加在亞相表面上，隨著氯仿在亞相表面的鋪散，膠原蛋白肽呈分散狀態(tài)，分子間距較遠(yuǎn)，單分子所占面積大，呈現(xiàn)出LB膜制備過程中氣相狀態(tài)特點(diǎn)，表面壓幾乎為零。在氯仿溶劑揮發(fā)干凈后，隨著滑障的壓縮膠原蛋白肽分子互相靠近，單分子所占面積變小，當(dāng)分子間距離縮短至液相狀態(tài)，可以檢測到表面壓開始緩緩上升。繼續(xù)壓縮，亞相表面上的膠原蛋白分子由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變，分子間距快速減小，表面壓快速上升，此時(shí)形成固相狀態(tài)的單分子膜，分子之間排列緊密。繼續(xù)壓縮，可以使分子間距到達(dá)最小值，表面壓升至最高，即為其崩潰壓力，再壓縮則形成的單分子層會瞬間崩潰。經(jīng)圖3結(jié)果中可以看出，膠原蛋白肽的成膜過程符合標(biāo)準(zhǔn)朗格繆爾膜成膜過程的相關(guān)特性，其崩潰壓力為23.8 mN/m，維持表面壓為23 mN/m，可以得到穩(wěn)定的膠原蛋白肽單分子層，實(shí)現(xiàn)LB膜的固相轉(zhuǎn)移，制備膠原蛋白肽覆層羥基磷灰石材料。

圖3面積-表面壓圖像

2.3覆層羥基磷灰石材料性能研究

2.3.1 AFM表征

利用AFM對膠原蛋白肽覆層羥基磷灰石材料性質(zhì)進(jìn)行研究(結(jié)果見圖4)。從圖4中的AFM 3D圖像中可以看出轉(zhuǎn)移至羥基磷灰石表面上的膠原蛋白肽LB膜性質(zhì)良好，形成的單分子層呈平鋪狀態(tài)，分子分散均勻，厚度相對均勻，經(jīng)估算單層厚度約為3.1 nm，2層厚度為5.7 nm，3層為8.9 nm，4層為11.7 nm。通過軟件測得單層膠原蛋白肽LB膜表面粗糙度Ra(輪廓算術(shù)平均偏差)為0.9 nm，表明膜的表雖不完全平坦，但相對均勻。這表明通過LB膜技術(shù)可以制備出膠原蛋白肽覆層的羥基磷灰石材料，并且可以根據(jù)需求制備單層、雙層、多層的覆層材料，滿足不同應(yīng)用需求。

圖4空白羥基磷灰石材料與覆層材料AFM 3D圖像

2.3.2材料穩(wěn)定性

通過用生理鹽水對材料進(jìn)行浸泡、多次沖洗，檢測覆層4層羥基磷灰石材料中膠原蛋白肽的泄露，來評價(jià)生物覆層材料的穩(wěn)定性。對收集的浸泡液、沖洗液濃縮100倍，通過微量Lowry法檢測其蛋白濃度，在浸泡液中未檢出膠原蛋白肽，沖洗液檢測結(jié)果見表2。從表中結(jié)果可以看出隨著沖洗次數(shù)增多，泄露的膠原蛋白肽呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，說明覆層的膠原蛋白肽會有一定的脫落，但不會一直脫落，經(jīng)折算，脫落膠原蛋白肽總量僅占覆層總量的0.01%，因此制備的覆層材料是穩(wěn)定可靠的。

表2沖洗液檢測結(jié)果表

2.3.3力學(xué)性能

對羥基磷灰石和覆層材料的楊氏模量進(jìn)行了測量，結(jié)果如圖5所示。空白的羥基磷灰石材料的楊氏模量為3.14±0.16 MPa，隨著覆層層數(shù)的增加楊氏模量逐漸增加，最高可達(dá)6.21±0.18 MPa，說明膠原蛋白肽的覆層能夠有效地改善羥基磷灰石材料的力學(xué)性能，提高其楊氏模量。

圖5不同材料的楊氏模量

2.3.4生物性能

MC3T3-E1細(xì)胞在羥基磷灰石和覆層材料上培養(yǎng)5天的增殖情況見圖6。因結(jié)果類似，圖中僅列出了單層和4層覆層材料的增殖結(jié)果，可以看出在覆層材料上MC3T3-E1細(xì)胞增殖要優(yōu)于空白羥基磷灰石材料，表明所制覆層材料不僅無細(xì)胞毒性，而且因膠原蛋白肽的優(yōu)良生物相容性，能一定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖。所用的羥基磷灰石和膠原蛋白肽都是經(jīng)過實(shí)踐證明的生物相容性良好的材料，其對材料生物性能的提升作用是由其本身的生物相容性良好引起的，因此覆層層數(shù)對生物性能提升作用不明顯。

圖6不同材料細(xì)胞培養(yǎng)情況

3結(jié)論

1)本文建立了一種制備膠原蛋白肽覆層材料的新方法，利用LB膜技術(shù)將膠原蛋白肽覆層至羥基磷灰石上，制備了一種新型覆層生物材料。

2)通過堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合作用實(shí)現(xiàn)了均一分子量膠原蛋白肽的制備。將膠原蛋白肽覆層至羥基磷灰石片上，通過AFM表征發(fā)現(xiàn)膜的表面平整，單層厚度約為3.1 nm。

3)制備的材料性能穩(wěn)定，能有效提高羥基磷灰石材料的力學(xué)性能，生物相容性良好，能促進(jìn)細(xì)胞增殖。進(jìn)一步可以通過化學(xué)交聯(lián)提高覆層的穩(wěn)定性，為新型醫(yī)用生物材料開發(fā)提供借鑒。